Cuatro grupos de investigación de la Red de Enfermedades Tropicales (RICET) perteneciente al Instituto de Salud Carlos III han desarrollado unas proteínas fluorescentes rojas a partir de la luciérnaga y el pólipo marino Renilla reniformis.

Estas proteínas fluorescentes permitirán evaluar la patogenicidad in vivo a tiempo real, realizar estudios de cribado de fármacos de alto rendimiento y constituyen un sistema de alerta en ciertas enfermedades mucho más precoz que los propios síntomas. Las proteínas fluorescentes rojas, que han sido probadas con la vacuna para la leishmaniasis patentada por la propia RICET,  permitirán además reducir un 90% la cantidad de animales que exige sacrificar la actual metodología utilizada en experimentación, con la importancia ética que ello conlleva. 

Para que un estudio científico sea considerado significativo, normalmente se sacrifican unos 4 animales a la semana durante 8 semanas como media, es decir, 32 animales. A esto habría que añadir otros 32 animales que forman el grupo control. Si como suele ocurrir el estudiar fármacos se prueban varias dosis, con cada una de ellas deben sacrificarse esta misma cantidad de animales. En una investigación habitual se requieren unos 200 animales. Con la técnica de las proteínas fluorescentes de los investigadores de la RICET 1 ratón sirve para el seguimiento de las 8 semanas que dura el experimento, mientras que en los ensayos
clásicos habituales se necesitan 8 ratones, para sacrificar uno cada semana, es decir se reduciría un 90% la cantidad de animales sacrificados.

Una cepa de Leishmania ha sido modificada genéticamente para que contenga la proteína mCherry, una de las proteínas fluorescentes más poderosas y que además emite en una longitud de onda donde hay menos interferencia con la fluorescencia natural, ya que nuestro organismo también tiene algunas moléculas que son fluorescentes de forma natural.

La mCherry emite una luz con suficiente energía como para atravesar tejidos, lo que hace que sea fácilmente detectable. Esto ha permitido a los investigadores de la RICET seguir la evolución de una infección por leishmania con un detector de luz, sin necesidad de estar continuamente sacrificando grupos de animales como se hace habitualmente en experimentación.

La cepa modificada con la proteína fluorescente mCherry fue utilizada por los científicos para cribar varios fármacos con actividad leishmanicida como la miltefosina, anfotericina B y la paromomicina. Tras comprobar que la modificación genética de las cepas no afectaba a su virulencia, se provocaron después infecciones experimentales. Tomaron imágenes del mismo animal a diferentes tiempos de infección, demostrándose que la evolución de la lesión cutánea en las patas inoculadas con los parásitos se correspondía con la emisión de fluorescencia roja, la cual reflejaba el grado de carga parasitaria viable dentro de la misma, es decir, que la cantidad de fluorescencia total era proporcional a la cantidad de leishmanias presentes dentro del animal provocándole la infección.

Se comprobó además que la emisión de fluorescencia roja era un parámetro que se podía detectar antes que la aparición de la lesión en el animal, por lo que los investigadores de la RICET habían descubierto un sistema de alerta más precoz que la sintomatología en sí misma.

Utilizaron después la fluorescencia para contrastar la vacuna desarrollada por el grupo del Dr. José .María Requena, demostrándose claramente una vez más el efecto protector de la vacuna cuando se administró 4 semanas previas al desafío.

Los datos de esta investigación que comenzó en 2010 y ahora ofrece sus primeros resultados, han sido publicados recientemente en la revista PLoS NTD y son fruto de la colaboración ente cuatro grupos de investigación de la RICET: el  liderado por el Dr. Luis Rivas del Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC, Madrid) aportó su Know- How sobre las proteínas fluorescentes, el grupo de la Dra. Rosa María Reguera (Universidad de León-ULE) realizó la transformación de leishmanias en leishmanias fluorescentes, el Dr. Manuel Fresno del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBMSO, Madrid) desarrolló el seguimiento visual de animales fluorescentes y el Dr J.M. Requena también del CBMSO aportó la vacuna.

El aparato utilizado llamado IVIS ("In Vivo Imaging System), fue financiado hace cinco años por la RICET con un coste de 300.000 €,  contiene una cámara de alta sensibilidad que permite detectar la fluorescencia de los animales y además permite mantener al animal con una temperatura corporal adecuada y otra serie de características para el buen trato de los animales. El animal no permanece dentro más que algunos segundos.

Las proteínas fluorescentes tienen una gran ventaja sobre las bioluminiscentes. La bioluminiscencia es la emisión de luz porque una molécula se transforma en otra molécula y en ese proceso se libera luz.  Pero para conseguir esa bioluminiscencia, al animal se le hace ingerir una sustancia llamada sustrato para que se distribuya por todo el organismo. Después una enzima (proteína) llamada luciferasa (que es la que tiene la luciérnaga), rompe el sustrato provocando que se libere una luz. El problema es que el animal necesita ingerir “mucho” sustrato, el precio de este es elevado y sólo dura unos 20 minutos como mucho, porque pasado ese tiempo se metaboliza y se pierde.

En conclusión, se puede afirmar que la cepa de Leishmania con proteína roja fluorescente mCherry permite el seguimiento a tiempo real de una infección experimental, utilizando un 98% menos de animales de experimentación y atendiendo el principio bioético de las 3R (replace, reduce, refine): reemplazar animales por otras alternativas, reducir la cantidad de animales y refinar la información que se puede obtener con menos animales.

Referencias

Calvo-Álvarez E, Guerrero NA, Alvarez-Velilla R, Prada CF, Requena JM, Punzón C, Llamas MÁ, Arévalo FJ, Rivas L, Fresno M, Pérez-Pertejo Y, Balaña-Fouce R, Reguera RM. Appraisal of a Leishmania major strain stably expressing mCherry fluorescent protein for both in vitro and in vivo studies of potential drugs and vaccine against cutaneous leishmaniasis. PLoS Negl Trop Dis. 2012 Nov;6(11):e1927. doi: 10.1371/journal.pntd.0001927

Carrión J, Folgueira C, Soto M, Fresno M, Requena JM. Leishmania infantum HSP70-II null mutant as candidate vaccine against leishmaniasis: a preliminary evaluation. Parasit Vectors. 2011 Jul 27;4:150. doi: 10.1186/1756-3305-4-150